Čo je bakulovírus?
Bakulovírus môžeme opísať ako obalené vírusy, ktoré infikujú larvy hmyzu väčšinou z Lepidoptera. Ak sa pozrieme na ich genetickú štruktúru, zistíme, že majú kruhový tvar a molekuly dvojvláknovej DNA s veľkosťou 80 až 180 kbp. Tieto molekuly sú balené vo forme tyčovitých nukleokapsidov s dĺžkou 200 až 400 nm a priemerom 40 až 50 nm.
Existujú rôzne verzie bakulovírusu, ale AcMNPV (viacnásobné nukleopolyhedrovírusy Autographa californica je najbežnejším typom; ktorý sa používa v rôznych klinických štúdiách a využívaní biologických procesov.
Ako sa to nakazí?
Infikuje rovnakým spôsobom ako iné vírusy, ale počas svojho infekčného cyklu produkuje dva rôzne fenotypy. ODV (Occlusion Derived Viruses) iniciuje infekciu priamo z lariev. Je tiež známy ako štádium primárnej infekcie. Potom vírusové potomstvo zahŕňa BV (Budded Viruses), ktoré sú zodpovedné za uskutočnenie systematickej infekcie.
Takéto typy viriónov sa líšia v mechanizme prenosu infekcie a to závisí od ich bunkových typov; ODV infikuje epitelové bunky stredného čreva až o 10 000 viac ako BV. Na druhej strane, BV je 1000-krát účinnejší ako ODV – pokiaľ ide o infikovanie kultivovaných buniek.
BV fenotyp je vo všeobecnosti zodpovedný za sprostredkovanie vírusovej propagácie v bunkovej kultúre. Ale väčšina dostupných informácií týkajúcich sa mechanizmu bakulovírusovej infekcie je založená na rôznych štúdiách vykonaných na hmyzích bunkách, ktoré sú infikované BV.
Expresia fosfolipázy A2 z včelieho jedu z Apis Cerana Cerana v bunke Baculovirus-Insect CellAbstract
BVPLA2, tiež známy ako fosfolipáza A2 včelieho jedu, je lipolutický enzým, ktorý katalyzuje hydrolýzu sn-2 acylovej väzby glycerofosfolipidov za uvoľnenia lyzofosfolipidov a mastných kyselín. V tejto klinickej štúdii bol AccPLA2 získaný z Apis cerana cerana, jed čínskej včely, injikovaný do bacmidu, aby sa vyvinul rekombinantný prenosový vektor. Bunky Tn-5B-4(Tn) boli infikované rekombinantnou bacmidovou DNA. Podľa analýzy SDS-PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným) sa zistilo, že molekuly s dvojitým pásom vážili 16-18 kDA. A konečný produkt hexahistidínového fúzneho proteínu AccPLA2 ukázal akumuláciu až 5,3 % dostupných bunkových proteínov.
Fúzny proteín AccPLA2 tiež vykazoval skríženú reakciu s BVPLA2 polyklonálneho séra Apis mellifera (európska včela medonosná). Táto reakcia vedie k vytvoreniu dvojitého glykozylačného pásu, ktorý je v súlade s pásom vytvoreným natívnou AmPLA2 – podľa analýzy Western blot. Aktivita PLA2 extrahovaného bunkového proteínu je asi 3,16 µmol/ (min-mg) v hydrolyzujúcom vaječnom žĺtku. Nakoniec sa rekombinantný proteín AccPLA2 môže použiť na glykozyláciu Tn buniek. Vo svetle týchto zistení získané výsledky poskytujú základné znalosti potrebné pre potenciálne genetické inžinierstvo na produkciu AccPLA2 na farmaceutické účely.
Úvod
PLA2 a EC 3.1.1.4 je obrovská rodina lipolytických enzýmov, ktoré katalyzujú hydrolýzu sn-2 väzby glycerofosfolipidov za uvoľnenia lyzofosfolipidov a mastných kyselín. PLA2 má rôzne základné funkcie, pokiaľ ide o bunkové spracovanie; ktorý reguluje vylučovanie kyseliny arachidónovej a pôsobí ako prekurzor eikosanoidov silného zápalového mediátora. Okrem toho PLA2 hrá integrálnu úlohu pri oddialení bunkovej smrti v dôsledku oxidačnej indukcie, prestavby membrány, procesov prenosu signálu a aterosklerózy a obrany hostiteľa. PLA2 je tiež spojená s rôznymi ľudskými poruchami, ako je endotoxický a septický šok, infarkt myokardu, syndróm respiračnej tiesne, autoimunitná uveitída a reumatoidná artritída.
Enzým PLA2 možno nájsť z rôznych zdrojov, ako sú synoviálne tekutiny, hmyzí a plazí jed a pankreas cicavcov. Tieto enzýmy sú klasifikované do 15 rôznych, ale úzko súvisiacich skupín podľa úrovne homológie na základe aminokyselinových a nukleotidových sekvencií. Môžeme povedať, že PLA2 môžeme pre klinické vyšetrenie rozdeliť do 3 rôznych skupín.
Skupina I pozostáva z pankreasu cicavcov a jedu kraitov, skupina II pozostáva z jedu zmije a krotalíd a posledná skupina, skupina III, pozostáva zo škorpióna/jašterice/včelieho jedu. BVPLA2 je členom skupiny III a tvorí takmer 12 % celkovej suchej hmotnosti včelieho jedu nájdeného v Apis millifera. Môžeme povedať, že BVPLA2 je najsilnejší peptid včelieho jedu. Prirodzene sa správa ako alergén, ktorý spolupracuje s prepojenými zložkami pri obrane včelstva pred akýmikoľvek votrelcami a predátormi.
Melittín je ďalšou zložkou včelieho jedu, ktorý urýchľuje úroveň aktivity BVPLA2. BVPLA2 má niekoľko farmakologických znakov, ktoré zahŕňajú indukciu rastu neuritov, myotoxicitu a neurotoxicitu a aktivitu HIV. Existuje čerstvá nukleotidová sekvencia BVPLA2 nájdená z Apis millifera. AmPLA2 aminokyselinové sekvencie obsahujú proregión zvyškov PLA2 (peptid s 18 aminokyselinami). Je to zrelý peptid, ktorý obsahuje 10-cystínový zvyšok, ktorý môže vytvárať 5-disulfidové väzby. Katalyzačná aktivita a kryštálová štruktúra PLA2A boli zdokumentované v rôznych klinických štúdiách uskutočnených pred niekoľkými rokmi.
Apis cerana, tiež známa ako ázijská včela medonosná, je tiež najbežnejším druhom včiel medonosných vyskytujúcich sa v južnej a juhovýchodnej časti Ázie. Predpokladá sa, že Apis cerana, poddruh ázijskej včely medonosnej, má viac ako 3000 rokov. Čínski farmári si dobre uvedomujú dôležitosť týchto včiel a úspešne udržiavali kolóniu 1,2 milióna Apis cerana. Na druhej strane, európska včela medonosná, tiež známa ako Apis millifera, má obrovskú kolóniu 7,8 milióna včiel.
Jednou z najzaujímavejších vecí je, že jed čínskych aj európskych včiel má svoje biologické vlastnosti a vlastnosti. V predchádzajúcej klinickej štúdii bol zosilnený gén BVPLA2, ktorý kóduje pokročilý peptid čínskej včely medonosnej. Zistilo sa, že všeobecná expresia AccPLA2 povrchov od 5 d do 42 d robotníc včely čínskej. Táto štúdia bola založená na skúmanie expresie, enzymatickej aktivity, imunologických vlastností a glykozylácie rekombinantného AccPLA2 v hmyzích bunkách.
Metóda
PGEM-AcPLA2 bol vyvinutý podľa predpísanej metódy while; bunková línia Tn-5B-4 (Tn) bola starostlivo udržiavaná v laboratóriu. Novozélandské králiky boli získané z Čínskeho tradičného medicínskeho inštitútu v meste Zhejiang. Reštrikčné enzýmy HindIII a EcoRI, markery DL1500 a DL2000 sa získali od spoločnosti TaKaRa Company, Čína. Natívna AmPLA2, ktorá bola komerčne purifikovaná, bola získaná od Sigma Company, USA. Kmene E. coli DH10B, transferový vektor pFastBacHTa, hovädzie teľacie sérum a hmyzie bunky TNM-FH, Lipofectin, (IPTG) izopropyl beta-D-tiogalaktopyranozid, X-gal a T4 DNA ligáza boli získané od Invitrogen Corporation, USA. Kozí anti-králičí IgG konjugát, NC filter, proteínový molekulárny marker a Taq DNA polymeráza boli získané od Sino Promega Company, Čína. Zatiaľ čo súprava na extrakciu plazmidovej DNA bola získaná od Omega Bio Tek Corporation, USA. Hovädzí sérový albumín, deoxycholát sodný a chlorid vápenatý boli získané od Sangon Company, Čína. Zabezpečilo sa, že všetky biochemické činidlá získané z rôznych zdrojov majú najvyššiu komerčne dostupnú úroveň čistenia.
Novozélandským králikom bola podaná zmes 300 mg purifikovanej AmPLA2 spolu s 1 ml PBS. Tieto králiky boli podrobené vykrvácaniu počas viac ako 3 týždňov po ich primárnej imunizácii prostredníctvom 200 mg enzýmu, ktorý bol emulgovaný v neúplnom PBS (1 ml). Potom sa kontinuálne 3 týždne podávala injekcia s 200 mg enzýmu rozpusteného v 1 ml fyziologického roztoku. Získaná vzorka krvi sa analyzovala na zistenie hodnoty účinku podaného séra. Uskutočnilo sa to prostredníctvom natívnej AmPLA2 po 1 týždni druhej dávky zosilnenej imunizácie, riadenej pomocou protokolu gélovej difúzie, ako predložili Sambrook a Russell. Získané sérum sa skladovalo pri veľmi nízkej teplote -80 stupňov Celzia.
Intracelulárne proteíny infikovaných buniek, natívna AmPLA2 a normálne hmyzie bunky sa skúmali pomocou 10 % (obj./obj.) SDS-PAGE, opäť podľa metódy opísanej Sambrookom a Russellom. Gély boli zafarbené Coomassie brilantnou modrou R250. Koncentrácia exprimovaného fúzneho proteínu bola hodnotená skenovaním tenkej vrstvy SDS-PAGE gélu. Nefarbený proteín, oddelený, bol prenesený na nemodifikovanú NC membránu pre Western bloty. Tento proces sa uskutočnil v špeciálnom zariadení Bio-Rad transblot. Fúzny proteín sa skúmal pomocou králičieho antiséra proti natívnej AmPLA2. Proteíny boli detegované na blote cez kozí anti-králičí IgG konjugát, ako predpísali Sambrook a Russell.
Titrimetrický test PLA2 sa uskutočnil revidovanou metódou, ktorú predtým používali Owen et al. Čerstvý substrát vaječného žĺtka, ktorý bol rozmiešaný v 200 ml deionizovanej a destilovanej vody, bol denne čerstvý. Vaječná zmes bola vystavená teplu na 37 stupňov Celzia a neskôr bol primiešaný NaOH, aby sa udržala jej hodnota pH na 8,0. Tento proces sa uskutočnil v špeciálnej termostatovanej mikro reakčnej nádobe. PH stat titrácia sa uskutočňovala pomocou systému pH metra, ktorý pomáhal udržiavať hodnotu pH na 8,0 po pridaní 0,005 mol/l NaOH. Solubilizované proteínové extrakty boli starostlivo merané na ich koncentráciu v infikovaných bunkách a neskôr boli pridané do substrátovej zmesi. Purifikovaný AmPLA2 a BV prášok, ktorý bol zriedený v deionizovanej a destilovanej vode, boli použité ako pozitívna kontrola, zatiaľ čo extrakty Tn buniek boli vybrané ako negatívna kontrola.
Výsledok
EcoRI/Hind štiepený fragment AccPLA2 (cDNA) z pGem-AccPLA2 bol podaný do prenosového vektora pFastBacHTa. Produkty registrovaného štiepenia a PCR rekombinantného plazmidu mali pás 400 bp – celkom identický s fragmentom AccPLA2. Nukleotidové sekvenovanie tiež potvrdilo, že vložený fragment poskytuje správny ORF na expresiu proteínu. Podľa schematickej prezentácie rekombinantného transferového vektora sa zistilo, že vložený gén je riadený promótorom polyhedrínového jadrového vírusu polyhedrózy autographa californica. Exprimovaný gén bol prirodzene navrhnutý tak, aby vytvoril fúzny proteín, ktorý zahŕňa hexahistidín, ktorý sa nachádza na amino-konci, čo prípadne umožňuje jednostupňové čistenie pomocou imobilizovanej Ni2+ iónovej afinitnej chromatografie.
Akonáhle bol rekombinantný transferový vektor pFastBacHTa – AccPLA2 konvertovaný na bunky schopné E. coli DH10B, ktoré obsahujú bakulovírusový kyvadlový vektor bacmid, bol ďalej kultivovaný. Potom sa uskutočnila PCR identifikácia s bacmidovou DNA, ktorá sa izolovala z pozitívnych kolónií vo forme templátov s použitím priméru PUC/M13 a AccPLA2, v danom poradí. Našli sa 2 fragmenty, jeden asi 2700 bp a druhý 100 bp. Po preskúmaní sa zistilo, že sú ako fragment AccPLA2 v MCS (viacnásobné klonovacie miesta). Na druhej strane, bacmidový fragment s 2300 bp bol lokalizovaný v ľavom a pravom rozsahu bakteriálneho transpozónu TN7 + AccPLA2 fragmentu. Potvrdzuje, že rBacmid-AccPLA2 a rekombinantný bacmid boli vyvinuté presne.
Pomocou Lipofection bola rBacmid-AccPLA2 DNA sprístupnená v Tn bunkách v médiu. AccPLA2 sa ukázal 3 dni po infekcii rBacmid-AccPLA2 DNA. Po dokončení centrifugácie na generovanie buniek sa v supernatantoch na propagáciu použil amplifikovaný rBacmid v Tn bunkách, rTnV-Bac-AccPLA2. Po dokončení propagácie počas 4 generácií sa genómová DNA rTnV-Bac-AccPLA2 použila na vykonanie PCR identifikácie z infikovaných buniek. Elektroforetická analýza na agaróze ukázala, že produkty PCR mali 400 bp, čo bolo identické s génom AccPLA2; bolo teda potvrdené, že genómová DNA rTnV-Bac-AccPLA2 bola úspešne propagovaná v Tn bunkách.
Diskusia
Pred touto klinickou štúdiou nebol BVPLA2 exprimovaný v žiadnych hmyzích bunkách. Ale tu bol gén AccPLA2 úspešne exprimovaný v bunkách Tn. Zistilo sa, že sa zistilo, že exprimovaný fúzny proteín je aktívny, čo naznačuje, že bunky Tn môžu exprimovať správne modifikovaný AccPLA2. Zistenia tejto klinickej štúdie sú úplne v súlade s výsledkami predchádzajúcich klinických správ – Soldatova a kol., Altmann a kol. a Li a kol. Glykozyláciu rekombinantného proteínu možno označiť za dôležitý mechanizmus, ktorý priamo ovplyvňuje funkciu proteínu. Táto štúdia v kombinácii s predchádzajúcimi štúdiami môže poskytnúť vedecký základ pre molekulárno-biologické použitie AccPLA2 v budúcnosti.
Záver
Bunky Tn boli skonštruované transfekciou rekombinantnej bacmidovej DNA, ktorá sa stala súčasťou nového génu BVPLA2 prostredníctvom žliaz apis cerana cerana, aby pomohla exprimovať rekombinantný proteín AccPLA2. Je to štruktúra typu BVPLA2, ktorá má takmer rovnakú úroveň biologickej aktivity; to znamená, že môže byť ľahko glykozylovaný v Tn bunkách. Táto klinická štúdia môže poskytnúť základné, ale užitočné informácie nevyhnutné pre inžiniersku genetiku, ktorú možno použiť na výrobu AccPLA2 vo farmaceutickom priemysle.
Zdroj: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2865836/